糖基化修饰 (glycosylation）是目前最复杂的蛋白质翻译后修饰之一，其复杂性体现在：功能上，糖基化修饰对于蛋白质的折叠、定位和运输起重要作用，广泛参与调控新陈代谢、信号转导、免疫调节和肿瘤转移等多种生物学功能；另一方面，糖基化修饰蛋白质氨基酸种类繁多，包括丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺等至少9种氨基酸，并且修饰糖链 (结构、单糖类型)也呈现多元异质性变化。目前已知单糖类型多达数十种，包括甘露糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、唾液酸糖、木糖、岩藻糖等，部分单糖之间还可以相互链接，从而使得同一个糖基化位点最多可能发生几十种不同的糖基化修饰。如何利用组学方法实现糖基化修饰蛋白质的高通量精准鉴定和定量仍然是领域内亟待解决的关键科学问题。 近些年，随着富集手段与质谱技术的不断优化和革新，糖蛋白质组学在糖链结构的预测、检测实际上已经取得了许多突破性的进展，特别是，中科院计算所贺思敏研究员和复旦大学杨芃原教授发表的基于质谱的高通量糖基化肽段分析方法，为完整N糖蛋白质组学检测提供了新的技术理论基础 [1]；更为重要的是，利用糖蛋白质组学技术也成功帮助我们更为全面、系统地揭示了糖蛋白在卵巢癌、阿尔兹海默症等多种疾病过程中的生物学角色 [2],[3],[4]。然而，伴随着糖蛋白质组学技术产生的大量复杂组学数据，如今也使得数据解析相关工作面临巨大挑战。 2020年，来自美国密歇根大学安娜堡分校计算医学和生物信息学系的Alexey I. Nesvizhskii教授团队，在Nature Methods上发表了题为“Fast and Comprehensive N- and O-Glycoproteomics Analysis with MSFragger-Glyco” [5]的研究长文。他们在前期MSFragger搜索引擎工作基础上 [6]，结合迭代开放式检索（Iterative Open Search）和质量偏移策略（Mass Offset or Delta Mass），开发了MSFragger-Glyco搜索引擎。通过检索已发表的相关N- 和O-糖肽数据库，并与Byonic、pGlyco 2和SEQUEST等搜索引擎进行横向对比，发现MSFragger-Glyco搜索引擎可以更有效地检索N-和O-糖肽，并提供更为全面的信息。  一、MSFragger-Glyco流程 1）数据和数据库准备，并检测可能的糖基化位点（如检测到氧鎓离子或糖基化特异序列，如N糖：N-X-S/T；O糖：S/T，则加入索引）；2）条件判断：若包含可能的糖基化位点则后续进行糖链检索，若无糖基化位点则进行正常检索；3）基于Philosopher的FDR评估和校正。图1 MSFragger-Glyco数据检索流程二、MSFragger-Glyco可显著提高完整N-糖基化肽段鉴定数目通过与小鼠脑组织的N-糖基化修饰公共数据库 [7] 对比，MSFragger-Glyco检索结果中：1）糖基化谱图数显著提高（24,099 vs 43,998），N-糖肽数目提高56%，N-糖蛋白数目提高36%；2）检索时间缩短（核心步骤MSFragger-Glyco仅需1.5 min，6核，32Gb内存）；3）MSFragger-Glyco新检索到的位点中，主要贡献来自于UniProt中预测的位点和新发现的位点，而早期报道过的位点（可性度很高）中两次结果持平；4）与PGlyco 2.0结果和公开数据对比，可额外多发现775个N-糖基化位点；5）MS/MS谱图具备很高的质量（见下图3）。进一步表明，MSFragger-Glyco可有效地实现N-糖肽的鉴定，在覆盖前人报道位点的基础上还可发现更多的新位点。图2 MSFragger-Glyco与其他搜索引擎对比结果展示（N-糖）图3 HCD谱图：肽段 LSALDNLLNHSSIFLK（含糖链HexNAc2Hex7） 三、MSFragger-Glyco可应用于更为复杂的O-糖蛋白质组学研究 由于O-糖的糖链类型和修饰位点和基序较N-糖更为复杂，同时O-糖也缺乏合适的富集手段和数据解析工具，因此关于O-糖的生物学功能研究还比较滞后。为评价MSFragger-Glyco引擎在O-糖数据检索中的效果。作者通过比较早期文献发表（原数据为SEQUEST引擎）的同一数据 [8]，鉴定到的O-糖基化PSM（~300%）、O-糖肽（~200%）、O-糖蛋白（~100%）和O-糖基化位点（~150%）数据均有了极大的提升。值得注意的是，来自于血液中的O-糖基化PSM提升最为明显（~550%），通过分析血液蛋白O-糖的糖型组成，可发现血液中蛋白的O-糖基化中岩藻糖、唾液酸糖和硫酸化单糖的含量显著提升。图4 MSFragger-Glyco与其他搜索引擎对比结果展示（O-糖）图5 来自于不同组织或细胞的样品O-糖分布具有较大差别本文中，作者在MSFragger平台基础上，利用迭代开放式检索和质量偏移策略，整合糖基化相关算法，开发出了MSFragger-Glyco搜索引擎。该引擎可全面的对N-和O-糖基化的完整糖肽进行快速分析，在常规引擎搜索结果的基础上，可以提供更多的糖基化修饰信息。该引擎的发展，可进一步的拓展人们对于N-和O-糖基化修饰的认知范围，为糖基化修饰功能的深入研究提供更为前瞻性的思路。糖基化修饰（glycosylation）是一种重要且广泛存在的蛋白质翻译后修饰方式。生物体内一半以上的蛋白存在糖基化修饰，包括转录因子，糖代谢相关酶类等。参考应用与案例生理机制研究：糖基化修饰影响蛋白质空间构象、活性、运输和定位，广泛参与到细胞间识别、调控、信号传导、免疫应答、细胞转化等生理过程。 ※ 案例：SIRT1的O糖基化修饰调控细胞应激反应O-GlcNAcylation of SIRT1 enhances its deacetylase activity and promotes cytoprotection under stress. Nature Communications (IF=12.121).病理研究：异常的蛋白质糖基化修饰通常与许多疾病的病理进展有关，包括癌症、神经退行性疾病、肺部疾病、血液疾病和遗传病等。大多数糖蛋白质是潜在的药物作用靶标，这使糖蛋白成为临床和生物学研究中一类重要目标。※ 案例：磷酸化/糖基化修饰组学揭示肝母细胞瘤调控机制与潜在治疗靶点Global profiling of O-GlcNAcylated and/or phosphorylated proteins in hepatoblastoma. Signal Transduction and Targeted Therapy (IF=13.493). 疾病生物标志物：糖基化蛋白通常位于细胞表面且容易分泌到循环系统中，具有作为疾病诊断生物标志物的巨大潜力。※ 案例：Cancer Cell：多维组学整合分析，揭示早期胃癌的分子特征Proteogenomic Characterization of Human Early-Onset Gastric Cancer. Cancer Cell (IF=26.602). 农林领域：糖基化修饰广泛应用于农林领域研究，研究证实糖基化修饰参与调控植物免疫、生长发育、逆境胁迫等重要生物学过程。※ 案例：种康院士团队揭示糖基化和磷酸化介导冬小麦春化反应开花的新机制The protein modifications of O-GlcNAcylation and phosphorylation mediate vernalization response for flowering in winter wheat. Plant Physiology (IF=6.902).本文由景杰学术团队报道，欢迎转发到朋友圈。如您需要搜索更多往期精彩内容，可点击公众号右上角人像标志后，在上方搜索框内通过关键词搜索相关内容。如有转载、投稿等其他合作需求，请文章下方留言，或添加微信ptm-market咨询。